荧光定量PCR服务：
简介：实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前该技术已被广泛用于检测细胞mRNA表达量的变化；比较不同组织的mRNA表达差异；验证基因芯片，siRNA干扰的实验结果等。我公司为您提供全套实时荧光定量PCR技术服务，全部实验皆使用进口试剂完成，主要定量PCR仪器。
1、荧光定量PCR服务要求：
（01）请您提供新鲜的且尽量多的材料；或直接提供纯化好的总RNA（大于 5 ug/样品）；或直接提供纯化好的DNA（大于 5 ug/样品）。
（02）请提供已知的全长基因序列。
（03）请提供尽可能详细的背景资料：DNA/RNA 来源等
2、产品仅供科研使用荧光定量PCR操作程序
（01）引物（探针）设计与合成。
（02）提取DNA/RNA，样本逆转录成cDNA。
（03）进行Real Time PCR实验，进行实验结果分析。
（04）实验完成后，提供完整的实验报告（含软件分析结果）及引物等实验材料。
3、荧光定量PCR的收费标准：
  我公司根据客户的样品数量进行不同的收费标准。
探针荧光定量PCR试剂盒原理分析如下图：

概述：
荧光定量PCR的基本原理就是在PCR扩增过程中，随着PCR循环数的递增，PCR产物不断积累，荧光信号也会相应的增加，这样就可以通过荧光强度的变化来对PCR反应进行实时的监测。本公司根据您的科研需求可以提供SYBR Green染料法和TaqMan探针法。通过对DNA或RNA的荧光定量PCR监测, 实现基因的相对定量、定量和定性分析。

使用方法：
一、犬链球菌探针法荧光定量PCR试剂盒稀释PCR阳性对照（以10E2-10E7拷贝/μL这6个10倍稀释度为例）
1. 注意：由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供可以直接使用的DNA片段作为阳性对照。
2. 标记6个离心管，分别为7，6，5，4，3，2。
3. 用带芯枪头分别加入45 μL荧光PCR专用模板稀释液（用带芯枪头，下同）。
4. 在7号管中加入5 μL 1×10E8拷贝/μL 的阳性对照，充分震荡1分钟，得1×10E7拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
5. 换枪头，在6号管中加入5 μL 1×10E7拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E6拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
6. 换枪头，在5号管中加入5 μL 1×10E6拷贝/μL的阳性对照到5号管中，充分震荡1分钟，得1×10E5拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
7. 重复上面的操作直到得到6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。
二、样品DNA的制备
8. 如果有N个样品，必须设置N+2个提取，多出的一个是PC（样品制备阳性对照），一个是NC（样品制备阴性对照）。可以用10μL上步制备的PCR阳性对照的第4号（浓度为1×10E4 拷贝/μL，10μL相当于1万拷贝）或第5号（浓度为1×10E5 拷贝/μL，10μL相当于10万拷贝）再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为PC。另外用水作为NC。如果每次制备需要200μL样品，则PC和NC的体积也必须是200μL。
9. 用自选方法纯化样品的DNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒DNA提取试剂盒兼容。
三、设置qPCR反应（20 μL体系，在样品制备室进行）
10. 如果只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照，6个用于PCR阳性对照。如果做2-3次重复，则反应设置数量相应增加2或3倍。
11. 产品仅用于科研在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后加）

实验过程：
产品仅供科研使用一、试剂准备
1. DNA模板
2．对应目的基因的特异引物（在PCR反应中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能继续按照模板DNA复制，而不能从无到有，凭空合成。这一小段序列就是你所要有设计的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根据你的模板链设计。因此，扩增不同的基因需要设计不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步骤
1．在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。
2．调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。一般：在93℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循环30-35次，zui后在72℃ 保温7min。
3．结束反应，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。
4．PCR的电泳检测：如在反应管中加有石蜡油，需用100μlLuFang进行抽提反应混合液，以除去石蜡油；否则，直接取5-10μl电泳检测。
三、注意事项
１．PCR反应应该在一个没有DNA污染的干净环境中进行。zui好设立一个专用的PCR实验室。
２．纯化模板所选用的方法对污染的风险有极大影响。一般而言，只要能够得到可靠的结果，纯化的方法越简单越好。
３．所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染。操作过程中均应戴手套。
４．PCR试剂配制应使用zui高质量的新鲜双蒸水，采用0.22μm滤膜过滤除菌或高压灭菌。
５．试剂都应该以大体积配制，试验一下是否满意，然后分装成仅够一次使用的量储存，从而确保实验与实验之间的连续性。
６．试剂或样品准备过程中都要使用一次性灭菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿应洗涤干净并高压灭菌。
７．PCR的样品应在冰浴上化开，并且要充分混匀。
实时荧光定量PCR：
实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。因此，实时荧光定量PCR无需内标是建立在两个基础之上的：
1）Ct值的重现性PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。
2）Ct值与起始模板的线性关系由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量测定，因此，实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线定量的方法。
外标准曲线的定量方法相比内标法是一种准确的、值得信赖的科学方法。利用外标准曲线的实时荧光定量PCR是迄今为止定量最准确，重现性*的定量方法，已得到全世界的公认，广泛用于基因表达研究、转基因研究，药物考核、病原体检测等诸多领域。

EFNB2 Protein Canine 重组狗 Ephrin-B2 / EFNB2 蛋白 (Fc 标签)2-氨基-4'-氯二苯甲酮质量规格：大于98%，化学2-amino-4'-chlorobenzophenone

U-87 MG(人神经细胞) 5×106cells/瓶×2 小鼠树突状细胞细胞;DCS原百部碱(标准品)质量规格：HPLC≥98%，标准品Protostemonine

人小气道上皮细胞裂解物HSAEpiCL雪上一枝蒿甲素质量规格：标准品,用于含量测定Bullatine A

CTF1 Others Human 人 Cardioophin-1 / CTF1 人细胞裂解液 (阳性对照) 麦冬皂苷D' 质量规格：HPLC≥98%，标准品ophiopogonin D'

小鼠血细胞;WEHI-3 [WEHI3]2'-O-(tert-Butyldimethylsilyl)紫杉醇质量规格：美国进口2'-O-(tert-Butyldimethylsilyl)paclitaxel
绵羊皮肤细胞;OAR-S1 小鼠原成骨细胞，MC3T3-E1 Subclone 14细胞 TM3细胞，正常小鼠Leydig细胞L-苯丙氨醇 质量规格：>98%,BRL-Phenylalaninol

人皮肤成纤维细胞;HSAS4L-色氨醇 质量规格：0.97L-Tryptophanol

HA Others H11N9 甲型 H11N9 (A/mallard/Alberta/294/1977) 血凝素 (Hemagglutinin / HA) 人细胞裂解液 (阳性对照) Fmoc-缬氨醇 质量规格：>98.5%,BRFmoc-Valinol

CL-0354HFSF(人胚胎眼巩膜成纤维细胞)5×106cells/瓶×2L-赖氨酸质量规格：HPLC≥98%，标准品L-Lysine

NOV Others Human 人 CCN3 / NOV 杆状病毒-昆虫细胞裂解液 (阳性对照) L-赖氨酸质量规格：>98%,BRL-Lysine
CM-R067大鼠肾足突细胞完全培养基100mL2-(5-溴-2-偶氮)-5-(二乙基)本酚100毫克保存：-20℃

EC109，人细胞CBZ-D-缬酸 CBZ-D-Valine,99% 1685-33-2 5G 通用试剂

EB病毒转化的人B细胞;KMY0926 人脑动脉平滑肌细胞完全培养基 100mL录加醋异炳酯(约30%的本,约2mol/L)(+4℃) Isopropyl xlonofonmctq 108-3-6

大鼠肺泡巨噬细胞;NR8383[AgC11x3A; NR8383.1]动力-吲哚-尿素培养基基础shēng huà shì jì容量：25克

IL23R Others Rat 大鼠 IL23R / IL23 Receptor 人细胞裂解液 (阳性对照) 79803-73-93-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸钠 (MOPSO-Na)MOPSO wo7ium salt
犬链球菌探针法荧光定量PCR试剂盒人T细胞细胞;HuT 78洛沙坦Losartan Carboxaldehyde质量规格：美国进口

人卵巢成纤维细胞(HOF) ( 5×105 )N,O-双(叔丁基二甲硅基)乙酰胺(>95.0%(GC))N,O-Bis(tert-butyldimethylsilyl)acetamide 质量规格：>95.0%(GC)

CM-R048大鼠肠巨噬细胞完全培养基100mL1-(二甲基异丙基硅基)咪唑(>98.0%(T))1-(Dimethylisopropylsilyl)imidazole质量规格：>98.0%(T)

小鼠色素瘤细胞;B16 小鼠肝实质细胞完全培养基 100mL1,3-双(氯甲基)四甲基二硅氮烷(>95.0%(GC))1,3-Bis(chloromethyl)tetramethyldisilazane质量规格：>95.0%(GC)

MA, 小鼠星形胶质细胞 Mouse1,3-二苯基四甲基二硅氮烷(>95.0%(GC))Tetramethyl-1,3-diphenyldisilazane质量规格：>95.0%(GC)