概述：
荧光定量PCR的基本原理就是在PCR扩增过程中，随着PCR循环数的递增，PCR产物不断积累，荧光信号也会相应的增加，这样就可以通过荧光强度的变化来对PCR反应进行实时的监测。产品仅供科研使用本公司根据您的科研需求可以提供SYBR Green染料法和TaqMan探针法。通过对DNA或RNA的荧光定量PCR监测, 实现基因的相对定量、定量和定性分析。

实时荧光定量PCR：
实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。因此，实时荧光定量PCR无需内标是建立在两个基础之上的：
1）Ct值的重现性PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。
2）Ct值与起始模板的线性关系由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量测定，因此，实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线定量的方法。
外标准曲线的定量方法相比内标法是一种准确的、值得信赖的科学方法。利用外标准曲线的实时荧光定量PCR是迄今为止定量最准确，重现性*的定量方法，已得到全世界的公认，广泛用于基因表达研究、转基因研究，药物考核、病原体检测等诸多领域。
探针荧光定量PCR试剂盒原理分析如下图：

使用方法：
一、摩氏摩根菌探针法荧光定量PCR试剂盒稀释PCR阳性对照（以10E2-10E7拷贝/μL这6个10倍稀释度为例）
1. 注意：由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供可以直接使用的DNA片段作为阳性对照。
2. 标记6个离心管，分别为7，6，5，4，3，2。
3. 用带芯枪头分别加入45 μL荧光PCR专用模板稀释液（用带芯枪头，下同）。
4. 在7号管中加入5 μL 1×10E8拷贝/μL 的阳性对照，充分震荡1分钟，得1×10E7拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
5. 换枪头，在6号管中加入5 μL 1×10E7拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E6拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
6. 换枪头，在5号管中加入5 μL 1×10E6拷贝/μL的阳性对照到5号管中，充分震荡1分钟，得1×10E5拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
7. 重复上面的操作直到得到6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。
二、样品DNA的制备
8. 如果有N个样品，必须设置N+2个提取，多出的一个是PC（样品制备阳性对照），一个是NC（样品制备阴性对照）。可以用10μL上步制备的PCR阳性对照的第4号（浓度为1×10E4 拷贝/μL，10μL相当于1万拷贝）或第5号（浓度为1×10E5 拷贝/μL，10μL相当于10万拷贝）再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为PC。另外用水作为NC。如果每次制备需要200μL样品，则PC和NC的体积也必须是200μL。
9. 用自选方法纯化样品的DNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒DNA提取试剂盒兼容。
三、设置qPCR反应（20 μL体系，在样品制备室进行）
10. 如果只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照，6个用于PCR阳性对照。如果做2-3次重复，则反应设置数量相应增加2或3倍。
11. 产品仅用于科研在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后加）

荧光定量PCR服务：
产品仅供科研使用简介：实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前该技术已被广泛用于检测细胞mRNA表达量的变化；比较不同组织的mRNA表达差异；验证基因芯片，siRNA干扰的实验结果等。我公司为您提供全套实时荧光定量PCR技术服务，全部实验皆使用进口试剂完成，主要定量PCR仪器。
1、荧光定量PCR服务要求：
（01）请您提供新鲜的且尽量多的材料；或直接提供纯化好的总RNA（大于 5 ug/样品）；或直接提供纯化好的DNA（大于 5 ug/样品）。
（02）请提供已知的全长基因序列。
（03）请提供尽可能详细的背景资料：DNA/RNA 来源等
2、荧光定量PCR操作程序
（01）引物（探针）设计与合成。
（02）提取DNA/RNA，样本逆转录成cDNA。
（03）进行Real Time PCR实验，进行实验结果分析。
（04）实验完成后，提供完整的实验报告（含软件分析结果）及引物等实验材料。
3、荧光定量PCR的收费标准：
  我公司根据客户的样品数量进行不同的收费标准。
人骨骼肌成肌细胞cDNAHSkMM cDNA1,4-α-D-葡聚糖麦芽水解酶，英文名或英文缩写：β-Amylase，级别：BR，4000u/g，规格：5克

GPNMB Others Human 人 GPNMB / HGFIN 人细胞裂解液 (阳性对照) 3,4’-二安基二本迷 3,4'-Oxydicnilinq 627-87-6

3T3?L1 小鼠脂肪细胞N-DODECYL-β-D-MALTOSIDEN-十二烷基-β-D-麦芽糖苷*白色粉末FROZENsigma

CL-0246YAC-1(小鼠瘤细胞)5×106cells/瓶×2肝嶙脂钠盐，英文名或英文缩写：Heparin wo7ium salt，级别：BR，1500-3000u/mg，规格：1克

rCF, 大鼠成纤维细胞10318-18-0DL-半胱酸盐酸盐;DL-2-基-3-酸盐酸盐DL-Cysteine xy7nochloride
AMPK Others Human 人 AMPK (G1/B2/A1) Heteroimer 杆状病毒-昆虫细胞裂解液 (阳性对照) 2.0ml离心管shēng huà shì jì容量：1KU

CL-0241VCaP(人细胞)5×106cells/瓶×21-氧基2-炳醇 1-Mqthoxy-2-propcnol 107-98-

HUVEC-12, 人脐内皮细胞系 昆虫卵巢细胞，SF9细胞 NK-92(人恶性非霍奇金瘤患者的自然杀伤细胞)蚕蛹蛋白胨shēng huà shì jì容量：保存：-20℃100毫克

人导管癌细胞;ZR-75-30Zincphosphatemonobasic嶙酸二氢锌100克AR，99%

CHIT1 Others Human 人 CHIT1 / Chitinase-1 人细胞裂解液 (阳性对照) 596-03-24，5-二溴荧光素4',5'-DIBROMOFLUORESCEIN
人急性T细胞细胞;Jurkat, Clone E6-1异鲁米诺(>98.0%(HPLC)(T))Isoluminol质量规格：>98.0%(HPLC)(T)

IL18R1 Others Mouse 小鼠 IL18R1 / CD218a 人细胞裂解液 (阳性对照) 草酸双[2,4,5-三氯-6-(戊氧羰基)苯基]酯(>98.0%(HPLC))Bis[3,4,6-trichloro-2-(pentyloxycarbonyl)phenyl] Oxalate质量规格：>98.0%(HPLC)

中国仓鼠卵巢细胞(亚系克隆);CHO-DUKXB11-prepro-TGFβ1 Cdna-TGF-β1 Dinding Protein cDNA8-氨基-1,3,6-萘三磺酸二钠盐水合物(>99.0%(HPLC)(T))Di 8-Amino-1,3,6-naphthalene 3sulfonate Hydrate质量规格：>99.0%(HPLC)(T)

ROBO2 Others Human 人 ROBO2 人细胞裂解液 (阳性对照)  102(>97.0%(HPLC)(N))Coumarin 102质量规格：>97.0%(HPLC)(N)

成纤维细胞Many types of cells包装：5 × 105方(1ml) 314(>98.0%(HPLC)(N))Coumarin 314质量规格：>98.0%(HPLC)(N)
摩氏摩根菌探针法荧光定量PCR试剂盒人胚肺二倍体细胞;HL橙皮苷(标准品）Hesperidin质量规格：HPLC≥98%，标准品

HA Others H5N1 甲型 H5N1 (A/whooper swan/Mongolia/244/2005) 血凝素 (Hemagglutinin / HA) 人细胞裂解液 (阳性对照) 橙皮苷Hesperidin质量规格：HPLC≥90%,BR

人间充质干细胞-骨髓总RNAHMSC-bm NA橙皮素(标准品)Hesperitin质量规格：HPLC≥98%，标准品

PARP1 Others Mouse 小鼠 PARP-1 / PARP 杆状病毒-昆虫细胞裂解液 (阳性对照) 虫草素(标准品)Cordycepin质量规格：HPLC≥98%，标准品

家猫肺细胞;FCA-L1川陈皮素;蜜橘黄素Nobiletin质量规格：HPLC≥98%,BR
实验过程：
一、试剂准备
1. DNA模板
2．对应目的基因的特异引物（在PCR反应中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能继续按照模板DNA复制，而不能从无到有，凭空合成。这一小段序列就是你所要有设计的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根据你的模板链设计。因此，扩增不同的基因需要设计不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步骤
1．在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。
2．调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。一般：在93℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循环30-35次，zui后在72℃ 保温7min。
3．结束反应，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。
4．PCR的电泳检测：如在反应管中加有石蜡油，需用100μlLuFang进行抽提反应混合液，以除去石蜡油；否则，直接取5-10μl电泳检测。
三、注意事项
１．PCR反应应该在一个没有DNA污染的干净环境中进行。zui好设立一个专用的PCR实验室。
２．纯化模板所选用的方法对污染的风险有极大影响。一般而言，只要能够得到可靠的结果，纯化的方法越简单越好。
３．所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染。操作过程中均应戴手套。
４．PCR试剂配制应使用zui高质量的新鲜双蒸水，采用0.22μm滤膜过滤除菌或高压灭菌。
５．试剂都应该以大体积配制，试验一下是否满意，然后分装成仅够一次使用的量储存，从而确保实验与实验之间的连续性。
６．试剂或样品准备过程中都要使用一次性灭菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿应洗涤干净并高压灭菌。
７．PCR的样品应在冰浴上化开，并且要充分混匀。