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非酶多糖清除剂(RNA样品专用)操作步骤

发表时间:2022-06-08
非酶多糖清除剂(RNA样品专用)操作步骤:
1  切取含有目的DNA 片段的琼脂糖凝胶条带。
● 尽量切除不含有目的DNA 部分的凝胶,减少凝胶体积,提高DNA 回收率。
● 切胶时,请使用长波长UV  (360 nm )光盒。且不要将DNA 长时间暴露在紫外灯下,以防DNA 损伤。
2  称取凝胶的重量近似地确定其体积。
● 凝胶重量的称量方法:取1.5 ml 离心管电子天平称初质量,切胶装在离心管后称终质量,两者差即为胶的质量。不同厂家离心管的重量可能有差异,因此,每个离心管的重量需单独称量。
3  按照每100 mg 琼脂糖凝胶对应100 μl 溶液BD 的比例,向离心管中加入溶液BD。
4  50 ℃水浴7-10min,直至凝胶完全溶化。期间需要振荡混合3 次。
● 琼脂糖必须完全融化,以免堵塞柱子,严重影响DNA 片段的回收效率。
● 如果总体积大于500 μl,可适当增加溶胶时间。
● 若此时溶液变红,可加10 μl 3M NaAC  (pH 5.2)。
5  将步骤4 所获溶液置于DNA 纯化柱中,静置2min 。
● 胶块完全溶解后最好将胶溶液温度降至室温再上柱,因为纯化柱在较高温度时结合DNA  的能力较弱。
6  12,000 rpm 离心1min。若溶液量大于DNA 纯化柱的容积,可分两次离心,弃滤液。
● 此时DNA 片段被吸附于DNA 纯化柱中的硅胶膜上。
7  加入500 μl 溶液BD。12,000 rpm,  离心1min,弃滤液
8  加入500 μl 溶液PE。12,000 rpm,  离心1min,弃滤液。
● 溶液PE 初次使用前用无水乙醇按1: 4 稀释,即含80% 乙醇。
● 此步骤的作用是将硅胶膜上吸附的蛋白、盐等杂质洗脱,以获得高质量DNA 片段。
9  加入500 μl 溶液PE。12,000 rpm,  离心1min,弃滤液。
10 12,000 rpm 离心  3min ,以彻底去除纯化柱中的液体。
● 此步骤的作用是去除残留乙醇,避免残留乙醇影响后续酶促反应。同时也利于DNA 片段的充分溶解。
11  将离心柱置于新的1.5 ml 离心管中。向纯化柱的中央处,悬空滴加30-100 μl 溶液Eluent  (60℃预热),静置2min 。12,000 rpm  离心1min,管底即为目的DNA 片段。贮存于-20℃。
● 溶液Eluent 可用无菌双蒸水代替,但其pH 需为8.0-8.5,加入体积视DNA 目的片段的多少、用户对目的片段浓度要求而定。

● 对溶液Eluent 60℃预热,会提高提取DNA 目的片段的产量。

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